在體外分離純化VX2腫瘤細(xì)胞，觀察其生物學(xué)特性. 方法：采用組織塊法和消化法結(jié)合對兔VX2腫瘤進行原代培養(yǎng),體外傳代觀察,傳代40次并對培養(yǎng)細(xì)胞進行形態(tài) 學(xué)觀察、細(xì)胞周期檢查、核型分析、兔及裸鼠移植. 結(jié)果：純化的兔VX2腫瘤細(xì)胞形態(tài)一致，呈圓形、多角形的上皮細(xì)胞,體積小,核漿比倒置,體外連續(xù)培養(yǎng)8 mo,傳代50次以上,細(xì)胞倍增時間為26.4 h,細(xì)胞周期測定G1期為74.61%, G2期為7.78%, S期為17.6%. 染色體為亞三倍體核型,眾數(shù)為60條. 高細(xì)胞濃度可保證同種移植成瘤率,裸鼠移植可成瘤, 無支原體污染. 結(jié)論：兔VX2腫瘤細(xì)胞系來源于Shope病毒致乳頭瘤惡變形成的鱗狀上皮細(xì)胞惡性腫瘤,目前已經(jīng)純化，可應(yīng)用于進一步腫瘤實驗研究.
【關(guān)鍵詞】 兔; 腫瘤細(xì)胞,培養(yǎng)的; 腫瘤標(biāo)記,生物學(xué) 0引言 兔VX2腫瘤是來源于Shope病毒致乳頭瘤惡變形成的上皮細(xì)胞惡性腫瘤，屬于鱗狀細(xì)胞癌，1940年建株［1］，國內(nèi)文獻對其來源描述不統(tǒng)一. 其特點可接種在兔體內(nèi)，具有較高的肺、肝轉(zhuǎn)移特性，在大型動物模型的研究上具有很高的應(yīng)用價值. 上一直沒有建成受到*并廣泛使用的VX2細(xì)胞系，多數(shù)仍以組織塊方法保存. 為進一步進行離體研究，我們分離并純化了VX2瘤株，并進行了生物學(xué)特性觀察.
1材料和方法
1.1材料新西蘭大白兔9只和BALB/c裸鼠均購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心；原代培養(yǎng)所用腫瘤組織來源于本院液氮保存冰凍組織塊，于新西蘭大白兔腿部肌肉內(nèi)接種并增殖. 胎牛血清（FBS, Gibco）；培養(yǎng)瓶（Costar）；RPMI 1640（Gibco）；24孔板（Nunc, Roskilde, Denmark）；廣譜抗細(xì)胞角蛋白（PCK）混合型鼠抗兔mAb（Boster），廣譜抗細(xì)胞波形蛋白鼠抗豬mAb（福州邁新公司）；秋水仙素（西安山川公司）離心機（LD52A，北京醫(yī)用離心機廠）；其他試劑及儀器取自唐都醫(yī)院中心實驗室. 1.2方法 1.2.1腫瘤細(xì)胞的分離純化無菌摘取VX2腫瘤邊緣增殖活躍部分,用PBS液沖洗3次,在顯微鏡下剔除多余組織，剪成直徑0.5～1.0 mm左右的小塊,以2.5 g/L胰酶加1 g/L膠原酶于37℃消化20 min，200目尼龍網(wǎng)過濾后800 r/min離心5 min，取沉淀物培養(yǎng)，較低密度接種于6孔板. 組織塊貼壁接種于預(yù)先涂抹薄層FBS的培養(yǎng)瓶（Costar）瓶底，瓶底朝上，向瓶內(nèi)加入含100 mL/L FBS和青鏈霉素雙 抗的RPMI 1640培養(yǎng)液5 mL，置37℃，50 mL/L CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi), 2 h后緩慢將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn). 消化法第2日即見細(xì)胞生長. 組織塊法于第3日組織塊均浮起，可見細(xì)胞生長. 于島狀生長的細(xì)胞處在倒置顯微鏡下無菌刮取，培養(yǎng)，取得多瓶純化細(xì)胞，其形態(tài)、生長速度基本一致. 待細(xì)胞成片生長、占據(jù)大部分瓶底時即用2.5 g/L胰蛋白酶于37℃下消化傳代.
1.2.2形態(tài)學(xué)觀察分別取純化后第10代和50代的細(xì)胞進行細(xì)胞爬片、HE染色、倒置顯微鏡鏡下觀察. 將VX2瘤接種于兔腿部肌肉，待成瘤后切片光鏡下觀察. 1.2.3生長特性測定將第50代細(xì)胞以1×107/L的密度接種于24孔板，每孔加入含100 mL/L FBS的1640培養(yǎng)基0.5 mL，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 每日同一時間用胰蛋白酶消化3孔細(xì)胞，血球計數(shù)板進行計數(shù)，連續(xù)進行4 d，繪制細(xì)胞生長曲線. 利用SPSS軟件指數(shù)函數(shù)擬合模型（Exponential）輔助計算細(xì)胞群體倍增時間［2］. 制作細(xì)胞爬片，分別于貼壁后24，48，72 h計算分裂指數(shù). 1.2.4瓊脂集落形成率測定收集第52代細(xì)胞和相應(yīng)的對照細(xì)胞，制備含細(xì)胞的3.5 g/L瓊脂糖液，并加到7 g/L瓊脂糖凝膠上，于37℃，50 mL/L CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng). 3 wk后計算集落形成率.
1.2.5免疫細(xì)胞化學(xué)分析取第55代細(xì)胞爬片，室溫下用1∶1混合的甲醇與丙酮將生長在蓋玻片上的細(xì)胞固定15～20 min，分別應(yīng)用PCK混合型鼠抗兔mAb及超敏加廣譜抗細(xì)胞波形蛋白鼠抗豬mAb行免疫組織化學(xué)染色，elisa試劑盒光學(xué)顯微鏡下觀察.
1.2.6染色體分析取處于80%匯合時的第60代細(xì)胞加入終濃度為0.3 mg/L的秋水仙素，在37℃，50 mL/L CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育5 h, 然后盡量吹打使阻斷于分裂中期的細(xì)胞脫壁，將細(xì)胞懸液裝入10 mL離心管. 1100 r/min離心10 min，去上清液，再向離心管中輕輕加入6 mL低滲鹽溶液75 mmol/L KCl，37℃靜置30 min. 然后加入2 mL新鮮固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）預(yù)固定，用移液管吹打調(diào)勻. 1100 r/min離心10 min，去上清液. 之后加入新鮮固定液8 mL，輕輕吹打均勻，離心10 min；本步驟再重復(fù)2遍. 末次離心后，小心吸除大部分上清液，余下0.5～1.0 mL固定液，輕輕吹打調(diào)勻. 吸少量細(xì)胞懸液，滴落在-20℃預(yù)冷過的潔凈載玻片上,迅速在酒精燈火焰上烤干. 制備好的玻片立即用Giemsa染色. 顯微鏡下觀察染色后的標(biāo)本，統(tǒng)計其染色體數(shù)目. 1.2.7細(xì)胞周期測定用2.5 g/L胰蛋白酶加0.25 g/L EDTA消化培養(yǎng)細(xì)胞，確保細(xì)胞盡可能打散，PRM 1640重懸后移至1.5 mL離心管中， PBS離心清洗3遍后，加入DPBS（Dulbeccos phosphate buffered saline）配制的750 mL/L冰乙醇，4℃固定2 h或過夜，PBS再離心清洗1遍后用1 g/L RNase 37℃消化20～30 min，DPBS離心清洗2遍，300目尼龍網(wǎng)過濾，0.2～0.3 mL DPBS重懸，PI染色5 min后流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期.
1.2.8同種異體移植取第60～70代的對數(shù)生長期細(xì)胞，將新西蘭兔分為3組，每組3只，分別以1×109，1×1010，1×1011個/L的細(xì)胞懸液4 mL接種于兔腿部肌肉，觀察腫瘤在肌肉內(nèi)的生長情況.
1.2.9裸鼠移植取第60～70代對數(shù)生長期細(xì)胞2×1011個/L,接種于3只BALB/c裸鼠腋窩皮下, 每只1 mL，觀察腫瘤在肌肉內(nèi)的生長情況.
1.2.10支原體及致高鈣血癥能力檢測采用地依紅染色及肉湯培養(yǎng)法檢測培養(yǎng)液及細(xì)胞內(nèi)支原體. 對成功接種VX2瘤的兔子進行耳緣靜脈采血，檢測血清鈣離子濃度［3-4］.
1.2.11細(xì)胞系的維持、凍存與復(fù)蘇取對數(shù)生長期細(xì)胞，用DHanks液漂洗3遍，2.5 g/L胰蛋白酶加0.2 g/L EDTA消化細(xì)胞5 min，收集細(xì)胞， 800 r/min離心5 min，用1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，每瓶細(xì)胞分種3～5瓶，同時凍存適量細(xì)胞，凍存液為培養(yǎng)液中加入100 mL/L血清及80 g/L二甲基亞砜，放入液氮罐中保存. 將盛有VX2細(xì)胞的冷凍管（已冷凍保存1 mo）從液氮中取出，37℃水浴，使細(xì)胞迅速融化，將細(xì)胞懸液移入預(yù)溫至37℃、含有100 mL/L血清的1640培養(yǎng)液中，置于37℃，50 mL/L CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞的成活率大于80%. 2結(jié)果 2.1細(xì)胞形態(tài)zui初純化的細(xì)胞部分在相差顯微鏡下可見扇形細(xì)胞質(zhì)（fanlike membranes）
經(jīng)過一段時間傳代，細(xì)胞呈上皮樣細(xì)胞排列, 單層貼壁生長,有鋪路石征，生長成團后即出現(xiàn)重疊生長現(xiàn)象，細(xì)胞以多邊形為. HE染色見細(xì)胞輕度嗜堿,核大,核質(zhì)比例異常, 細(xì)胞呈異型性明顯，可見較多核分裂象
2.2生長特性細(xì)胞生長于第3日達(dá)到高峰. 細(xì)胞倍增時間為26.4 h. 第55代細(xì)胞的生長曲線見圖4，細(xì)胞分裂指數(shù)分別為：24 h，1.9%；48 h，7.0%；72 h，9.3%. 雙層瓊脂形成率為22.1%. 圖1倒置顯微鏡下兔VX2腫瘤細(xì)胞呈扇形細(xì)胞質(zhì)×400（略） 圖2傳代后倒置顯微鏡下兔VX2腫瘤細(xì)胞呈多邊形為主×100（略） 圖3兔VX2腫瘤細(xì)胞形態(tài) ×100（略）
2.3免疫組織化學(xué)染色細(xì)胞胞質(zhì)中可見到PCK免疫組織化學(xué)染色弱陽性，波紋蛋白染色陰性.
2.4染色體分析在100個分裂中期細(xì)胞中，染色體數(shù)目主要分布于57～62之間，染色體眾數(shù)為60，多為亞三倍體. 染色體有缺失、斷裂、易位等結(jié)構(gòu)異常.
2.5細(xì)胞周期分析流式細(xì)胞儀分析 結(jié)果顯示G0/G1：74.61%； G2/M：7.78%； S：17.6%； G2/G1：1.87；DI：2.40. 圖4第55代細(xì)胞的生長曲線（略）
2.6同種異體移植及裸鼠移植以1×109個/L細(xì)胞密度接種的3只兔子均未成瘤；以1×1010個/L接種的有2只成瘤，其中1只于3 wk后停止生長，解剖后可見瘤體基本為豆渣樣壞死；以1×1011個/接種的有2只成瘤. 3只成功成瘤的兔子成瘤潛伏期約10 d，分別于36，38，45 d后衰竭死亡. 解剖后可見瘤體無包膜，呈侵潤性生長，中心豆渣樣壞死，多有大量膿血，廣泛轉(zhuǎn)移，與傳統(tǒng)組織塊接種法成瘤特點一致. 3只裸鼠均成瘤
兔VX2細(xì)胞裸鼠移植，可見后肢皮下有成瘤現(xiàn)象（略） 2.7支原體及致高鈣血癥能力檢測支原體檢測陰性. 動物在接種后1 wk化驗血鈣波動在2.1～2.5 mmol/L之間. 3討論 兔VX2腫瘤是世界上廣泛使用、可在大型動物體內(nèi)生長的惡性腫瘤，常用于惡性腫瘤介入和射頻治療的研究［
3-5］及影像學(xué)研究和動物模型的建立
［6-7］，其*性是小型實驗動物腫瘤模型所*的. 國內(nèi)經(jīng)常采用部位命名法來命名VX2腫瘤，如兔VX2肝癌，卻忽視了VX2瘤是乳頭瘤惡變而成的上皮來源的惡性腫瘤. 國外對于體外VX2細(xì)胞系的建立一直有爭議，Osato等zui早與1967年體外培養(yǎng)的VX2細(xì)胞由于培養(yǎng)箱故障而丟失
［8］，Voelkel等
［9］建立了一株VX2細(xì)胞系，活力成瘤能力低，并且喪失了產(chǎn)生PGE2的能力，沒有受到*. 1982年Easty等
［10］建立了VX2細(xì)胞系，與此同時瑞士的Rolf等也建立了該細(xì)胞株，并與之有差異，而比較結(jié)果沒有報道，細(xì)胞系也沒有廣泛應(yīng)用. 1985年Georges等［11］發(fā)現(xiàn)了2種不同的VX2瘤株，一種VX2R高表達(dá)角蛋白，僅能在裸鼠體內(nèi)成瘤，另一種VX2R低表達(dá)角蛋白，成瘤能力強. Dabbous等［
12］1980年也曾發(fā)現(xiàn)3種形態(tài)不同的VX2細(xì)胞. 劉險峰等
［13］純化了一株高表達(dá)角蛋白，高成瘤能力的VX2瘤株. 本實驗純化的VX2瘤株形態(tài)學(xué)上與文獻［8,10,11］的報道結(jié)果相似，致高鈣血癥能力檢測，與Doppelt等［14-15］的結(jié)果相同，從角蛋白表達(dá)低、接種后兔存活期短來看，惡性程度比較高，但是成瘤能力較國內(nèi)一些研究較弱. 我們還發(fā)現(xiàn)接種后有個別腫瘤自發(fā)性衰退的現(xiàn)象，與Osato等報道的VX7瘤自發(fā)性衰退相似. 結(jié)合本實驗和國外的文獻報道，考慮VX2自身可能發(fā)生一定程度的分化，這可能與VX2瘤在國內(nèi)外多以冰凍組織塊法保存有關(guān)，發(fā)生自發(fā)性衰退和惡性程度減低的細(xì)胞必然在傳代的過程中淘汰，因此懷疑VX2的惡性程度略有增高的可能性大，但是VX2腫瘤的基本性質(zhì)沒有變化，仍然是一株具有很高實用價值的應(yīng)用與大型實驗動物的腫瘤細(xì)胞. 1988年VX2瘤株從日本傳入我校以來，一直主要以液氮冷凍組織塊和動物體內(nèi)傳代結(jié)合的方法保存，為進行進一步體外研究，我們純化了該細(xì)胞系，經(jīng)過長時間傳代，性質(zhì)穩(wěn)定，可用于體外實驗. 實驗中發(fā)現(xiàn)的低細(xì)胞數(shù)量下成瘤能力下降和自發(fā)性消退現(xiàn)象，其原因尚需進一步研究.
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