僅供研究使用
TNF-A試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知TNF-A濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將TNF-A和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中TNF-A的濃度呈比例關(guān)系。 試劑盒內(nèi)容及其配制： | 試劑盒成份 | 96孔配置 | 48孔配置 | | 96/48人份酶標(biāo)板 | 1塊板（96T） | 半塊板（48T） | | 塑料膜板蓋 | 1塊 | 半塊 | | 標(biāo)準(zhǔn)品:400pg/ml | 1瓶（1.0ml） | 1瓶（0.5ml） | | 空白對照 | 1瓶（1.0ml） | 1瓶（0.5ml） | | 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液 | 1瓶（8.0ml） | 1瓶（4.0ml） | | 生物素標(biāo)記的抗TNF-A抗體 | 1瓶（8.0ml） | 1瓶（4.0ml） | | 親和鏈酶素-HRP | 1瓶（12ml） | 1瓶（5ml） | | 洗滌緩沖液 | 1瓶（20ml） | 1瓶（10ml） | | 底物A | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） | | 底物B | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） | | 終止液 | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） | 自備材料： 1. 蒸餾水。 2. 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。 3. 振蕩器及磁力攪拌器等。 1、血清……操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。 2、 血漿……EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。 3、 細(xì)胞上清液……1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。 4、 組織勻漿……將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液。 5、 保存……如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。 ● 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。 ● 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。 ● 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。 ● 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。 ● 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。 ● 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。 ● 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。 ● 按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。 安全性： 1. 避免直接接觸終止液和底物A、B，一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。 2. 實難中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。 3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。 試劑的準(zhǔn)備： 1. 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備，不能儲存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行： | 400 pg/ml | （6號標(biāo)準(zhǔn)品） | 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul | | 200 pg/ml | （5號標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | | 100 pg/ml | （4號標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | | 50 pg/ml | （3號標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | | 25 pg/ml | （2號標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | | 12.5 pg/ml | （1號標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | | 0 pg/ml | （空白對照） | 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul | 2. 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。 試劑盒性能： 1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。 2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。 3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。 操作步驟： 1. 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。 2. 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。 3. 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。 4. 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。 5. 每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。 6. 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。 7. 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。 8. 取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。 9. 在450nm波長處測定各孔的OD值。 結(jié) 果 判 斷 與 分 析： 1、 儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值 2、 以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的TNF-A標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的TNF-A含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 3、 檢測值范圍： 0-400pg/ml 4、 敏感度：1.0pg/ml
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