免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

 

 

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一，是由Coons等（1950）建立，經(jīng)過近43年的發(fā)展，免疫熒光技術(shù)與形態(tài)學(xué)技術(shù)相結(jié)合發(fā)展成免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)。它與親合化學(xué)技術(shù)如葡萄球菌A蛋白（SPA）、生物素與卵白素、植物血凝素（ConA等）相結(jié)合拓寬了領(lǐng)域；與激光技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)和掃描電視等技術(shù)結(jié)合發(fā)展為定量免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)；熒光激活細(xì)胞分類器（FACS）的應(yīng)用使免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)發(fā)展到更高的階段，開創(chuàng)了免疫熒光技術(shù)的新領(lǐng)域。細(xì)胞顯微分光光度計(jì)與與圖像分析儀的結(jié)合使免疫熒光組織化學(xué)的定量檢測(cè)更加準(zhǔn)確。在免疫熒光細(xì)胞化學(xué)中應(yīng)用單克隆抗體日益增多，將會(huì)不斷提高特異性、敏感性和應(yīng)用范圍。激光掃描等聚集顯微鏡的應(yīng)用又開創(chuàng)了新的發(fā)展時(shí)代。

　　由于免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的特異性，快速性和在細(xì)胞和分子水平定位的敏感性與準(zhǔn)確性，在免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞和組織學(xué)、病理學(xué)、腫瘤學(xué)以及臨床檢驗(yàn)學(xué)等生物學(xué)和醫(yī)學(xué)許多方面得到廣泛應(yīng)用，日益發(fā)揮重要的作用。

*節(jié)　免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的原理

　　免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量（圖3-1）。



圖3-1　紫外光激發(fā)熒光物質(zhì)放射熒光示意圖

　　用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，以熒光抗體方法較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。

　　免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分直接法、夾心法、間接法和補(bǔ)體法。

　　一、直接法

　　1．檢查抗原法 這是zui早的方法，用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗體，直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。此法很特異和簡(jiǎn)便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差（圖3-2）。



圖3-2 直接法

　　2．檢查抗體法 將抗原標(biāo)記上熒光素，即為熒光抗原，用此熒光抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗體反應(yīng)，而將抗體定位檢測(cè)出來。

　　二、間接法

　　1．檢查抗體法（夾心法）　　此法是先用特異性抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng)，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細(xì)胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法。

　　2．檢查抗體法　　用已知抗原細(xì)胞或組織標(biāo)本的切片，加上待檢血清，如果其中含有切片中某種抗原的抗體，抗體便沉淀結(jié)合在抗原上，再用間接熒光抗體（抗種屬特異性IgG熒光抗體）與結(jié)合在抗原上的抗體反應(yīng)（如檢測(cè)人血清中的抗體必需用抗人IgG熒光抗體等），在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應(yīng)部位呈現(xiàn)明亮的特異性熒光。此法是檢驗(yàn)血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段（圖3-3）



圖3-3　間接法

　　3．檢查抗原法雙薄片　　此法是直接法的重要改進(jìn)，先用特異性（對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)抗原）抗體（或稱*抗體）與細(xì)胞標(biāo)本反應(yīng)，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合的抗體，再用間接熒光抗體（也稱第二抗體，種特異性）與結(jié)合在抗原上的抗體（是第二抗體的抗原）結(jié)合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復(fù)合物。由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗全顯著多于直接法，從而提高了敏感性。如細(xì)胞抗原上每個(gè)分子結(jié)合3～5個(gè)分子抗體，當(dāng)此抗體作為抗原時(shí)又可結(jié)合3～5分子的熒光抗體，所以和直接法相比熒光亮度可增強(qiáng)3至4倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種*抗體的標(biāo)記顯示。這是現(xiàn)在zui廣泛應(yīng)用的技術(shù)。

　　三、補(bǔ)體法

　　1．直接檢查組織內(nèi)免疫復(fù)合物法　　用抗補(bǔ)體C3等熒光抗體直接作用組織切片，與其中結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的補(bǔ)體反應(yīng)，而形成抗原抗體補(bǔ)體復(fù)合物---抗補(bǔ)體熒光抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)陽性熒光的部位就是免疫復(fù)合物的存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢診斷等。



圖3-4　補(bǔ)體法

　　2．間接檢查組織內(nèi)抗原法　　常將新鮮補(bǔ)體與*抗體混合同時(shí)加在抗原標(biāo)本切片上，經(jīng)37℃孵育后，如發(fā)生抗原補(bǔ)體抗體反應(yīng)，補(bǔ)體就結(jié)合在此復(fù)合物上，再用抗補(bǔ)體熒光抗體與結(jié)合的補(bǔ)體反應(yīng)，形成抗原抗體—抗補(bǔ)體熒光抗體的復(fù)合物，此法優(yōu)點(diǎn)是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的*抗體的標(biāo)記顯示。

　　四、雙重免疫熒光標(biāo)記法

　　在同一細(xì)胞組織標(biāo)本上需要同時(shí)檢查兩種抗原時(shí)，要進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧?，一般均采用直接法，將兩種熒光抗體（如抗A和抗B）以適當(dāng)比例混合，加在標(biāo)本上孵育后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體，抗A抗體用異硫氰酸熒光素標(biāo)記，發(fā)黃綠色熒光；抗B抗體用TMRITC或RB200標(biāo)記，發(fā)紅色熒光，可以明確顯示兩種抗原的定位。

　　五、對(duì)照試驗(yàn)

　　為了保證免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色的準(zhǔn)確性，排除某些非特異性染色，必須在初次試驗(yàn)時(shí)進(jìn)行以上對(duì)照試驗(yàn)：

　　1．直接法　需設(shè)下述對(duì)照試驗(yàn)

　?。?）標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本只加PBS或不加PBS，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察應(yīng)呈陰性熒光（無與特異性熒光相似的熒光）。

　?。?）抑制試驗(yàn)：可分為二步法和一步法。

　?、俣揭种品ǎ簶?biāo)本先加未標(biāo)記的特異性抗體，再加標(biāo)記熒光抗體，結(jié)果應(yīng)呈陰性或明顯減弱的熒光。

　　②一步抑制法：先將熒光抗體用未標(biāo)記抗體作適量混合，再加在標(biāo)本上染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。此法效果較二步法好，并且簡(jiǎn)便。

　?。?）陽性對(duì)照：用已知陽性標(biāo)本作直接法免疫熒光染色，結(jié)果應(yīng)呈陽性熒光。

　　如對(duì)照（1）和（2）無熒光或弱熒光，（3）和待檢查標(biāo)本呈強(qiáng)熒光即為特異性陽性熒光。

　　2．間接法

　　（1）自發(fā)熒光對(duì)照：同上（一）。

　　（2）熒光抗體對(duì)照：標(biāo)本只加間接熒光抗體染色，結(jié)果陰性。

　?。?）抑制試驗(yàn)：同上。

　?。?）陽性對(duì)照：同上。

　　如對(duì)照（1）、（2）、（3）均呈陰性，陽性對(duì)照和待檢標(biāo)本陽性則為特異性熒光。

　　3．補(bǔ)體法

　?。?）自發(fā)熒光對(duì)照

　?。?）熒光抗體對(duì)照

　?。?）抑制試驗(yàn)

　　（4）補(bǔ)體對(duì)照：取新鮮豚鼠血清1：10稀釋先作用標(biāo)本，再用抗補(bǔ)體熒光抗體染色，結(jié)果陰性。

　?。?）抑制試驗(yàn)：標(biāo)本加滅活的*抗體，再用1：10稀釋度的新鮮豚鼠血清孵育后，再加未標(biāo)記的抗補(bǔ)體血清與抗補(bǔ)體熒光抗體等量混合稀釋液，結(jié)果應(yīng)為陰性。

　?。?）陽性對(duì)照：（1）～（5）結(jié)果陰性，（6）和待檢標(biāo)本陽性時(shí)，則為特異性熒光。

第二節(jié)　熒光抗體的制備

　　熒光抗體是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的重要技術(shù)之一，制備高特異性和價(jià)的熒光抗體必須選用高質(zhì)量的熒光素和高特異性價(jià)的免疫血清。

　　一、熒光素

　　熒光是指一個(gè)分子或原子吸收了給予的能量后即刻引起發(fā)光，停止能量供給，發(fā)光也瞬時(shí)停止（一般持續(xù)10-7～10-8s）?？梢援a(chǎn)生明亮熒光的染料物質(zhì)，稱熒光色素。目前主要常用的熒光色素有以下3種：

　　（一）異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate, GITC）

　　呈黃色、橙黃或褐黃色粉末或結(jié)晶，性質(zhì)穩(wěn)定，在室溫下能保存2年以上，在低溫中可保存多年。易溶于水和酒精。zui大吸收光譜為490～495nm，zui大發(fā)射光譜為520～530nm，呈現(xiàn)黃綠色熒光，分子量為398.4（圖3-5）。

　　在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵，成為標(biāo)記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。反應(yīng)式如下（圖3-6）：

　　一個(gè)Ig分子上zui多能 標(biāo)記15～20個(gè)FITC分子。



圖3-5　FITC的吸收光譜和發(fā)射光譜



圖3-6　抗體的FITC標(biāo)記反應(yīng)式

　　（二）四乙基羅達(dá)明（tetraethylrodamine B200, RB200）

　　呈褐紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。zui大吸收光譜為570nm，zui大發(fā)射光譜為595～600nm,呈明亮橙紅色熒光。分子量為580（圖3-7）。

　　RB200在五氯化磷（PCl5）作用下轉(zhuǎn)變成磺酰氯（SO2Cl），在堿性條件下易與蛋白質(zhì)的賴氨酸ε-氨基反應(yīng)結(jié)合而標(biāo)記在蛋白分子上?；瘜W(xué)反應(yīng)式如下（圖3-8）。



圖3-7　RB200在可見光區(qū)的吸收　圖3－8　RB200標(biāo)記抗體反應(yīng)

光譜和熒光光譜



圖3-8　RB200標(biāo)記抗體反應(yīng)

　?。ㄈ┧募谆惲蚯杷崃_達(dá)明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TMRITC）

　　它是一種紫紅色粉末，較穩(wěn)定。其zui大吸收光譜為550nm，zui大發(fā)射光譜620nm，呈橙紅色熒光，與FITC的黃綠色熒光對(duì)比清晰（圖3-9），與蛋白質(zhì)結(jié)合方式同TITC。它可用于雙標(biāo)記示蹤研究?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式如下（圖3-10）。



圖3-9　TMRITC在可見光區(qū)的吸收

光譜和發(fā)射光譜



圖3-10　 TMRITC結(jié)構(gòu)式

[NextPage]　　

二、熒光素標(biāo)記抗體的方法

　?。ㄒ唬〧ITC標(biāo)記抗體的方法

　　1．Marsshall 氏法

　?。?）材料：抗體球蛋白溶液、0.5mol/l pH9.0碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1%硫柳汞水溶液、三角燒瓶（25～50ml）、冰及冰槽（或1000ml燒杯）、電磁攪拌器、滅菌吸管、透析袋、玻棒、棉線及燒杯（500ml）、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等。

　?。?）方法及步驟：

　　①抗體的準(zhǔn)備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使zui后蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10，混勻，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌（速度適當(dāng)以不起泡沫為宜）5～10min。

　　②熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克蛋白加0.01mg 熒光素，用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。

　?、劢Y(jié)合（或稱標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完），加畢后，繼續(xù)攪拌12～18h。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右，故須及時(shí)添冰去水；亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫(kù)中。

　　④透析：結(jié)合完畢后，將球蛋白的溶液離心（2500r/min）20min，除去其中少量之沉淀物，裝入透析袋中后再置于燒杯中，用pH8.0緩沖鹽水透析（0～4℃）過夜。

　?、葸^柱：取透析過夜的標(biāo)記物，過葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，分離游離熒光素，收集標(biāo)記的熒光抗體進(jìn)行鑒定（圖3-11，圖-3-12）。



圖3-11　 Sephadex G-25 對(duì)FITC



圖3-12　FITC與家兔IgG球蛋白在25℃和2℃時(shí)結(jié)合的動(dòng)力學(xué)（Kawamura 1964）

　　洗脫液：0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）;過濾量:12ml標(biāo)記蛋白液（過濾前未透析）;收集量:20ml（稀釋1.7倍）。

　　分別以1mgFITC溶于2份1mol 0.5mol/L碳酸重碳酸鹽緩沖液（分別為pH9.5和pH9.0），于2℃下攪拌將其各加入100mg家兔IgG生理鹽水溶液中，攪勻后立即將每份分為兩半。一半保留于2℃下，另一半置25℃下。間隔一定時(shí)間后各取出0.5ml通過sephadex G-25去游離FITC，由上計(jì)算出5mg家兔IgG結(jié)合的FITC量。

　　2．Chadwick 氏法

　?。?）材料：抗原球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%重碳酸鈉水溶液、0.01mol/l Ph8.0磷酸鹽緩沖鹽水、1%硫柳汞、離心機(jī)及離心管、三角燒瓶（25ml）、冰槽、無菌吸管及毛細(xì)滴管、燒杯（500ml）、透析袋、棉線、玻棒等。

　?。?）方法及步驟：

　　①抗體準(zhǔn)備：用0～4℃pH8.0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg/ml，置入三角燒瓶?jī)?nèi)，放于冰槽中。

　　②熒光色素準(zhǔn)備：按每毫克蛋白加入熒光素0.01mg計(jì)算，稱取所需之熒光素量，用3%重碳酸鈉水溶液溶解。

　?、蹖?zhǔn)備之抗體與熒光色素溶液等量混合，充分?jǐn)噭?，?～4℃，冰箱中結(jié)合18～24h。

　　④透析和柱層析：方法同Marshall 氏法。

　　3．改良法（1963年） 　根據(jù)Marshall 氏法取高價(jià)的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水（0.15mol/l NaCl）及緩沖液（0.15mol/l NaHCO3 –Na2CO3 PH9.0） 稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白10mg,緩沖液為總量的10%，降溫至4℃，加入異硫氰酸鹽熒光素，（蛋白：熒光素=50～80mg:1mg），在0～4℃下電磁攪拌12～14h。然后用半飽和和硫酸銨將標(biāo)記球蛋白沉淀分離，除去未結(jié)合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨（用Nessler氏試劑測(cè)驗(yàn)至隔夜透析之鹽水無氨離子及熒光色素為止）。將制備好的熒光抗體加疊氮鈉0.01%,分裝在1ml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中（4℃）可以用半年以上，-20℃保存可達(dá)2年以上。

　　【附一】0.01mol/L pH7.2 PBS 配法：NaCl 18g 、Na2HPO41.5g、KH2PO40.2g,溶于2000ml蒸餾水中，校定pH至7.2。

　　【附二】0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液配法：取0.5mol/l Na2CO3（5.3%）10ml加入0.5mol/l NaHCO3（4.2%）90ml,混合后，校定pH至9.0。

　　【附三】3%重碳酸鈉水溶液配法：稱1.5g無水重碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。

　　4．透析標(biāo)記法　　 此法適用于小量抗體的熒光素標(biāo)記，標(biāo)記簡(jiǎn)便，非特異性染色較少。

　?。?）用0.025mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0，將欲標(biāo)記免疫球蛋白稀釋成1%濃度，裝入透析袋中。

　　（2）用同一緩沖液將FITC配成0.1mg/ml的溶液，按1%球蛋白液體積的10倍，將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內(nèi)，并使透析袋浸沒于FITC液中。容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒，在4℃電磁攪拌下，透析標(biāo)記24h。取出透析袋中標(biāo)記液，即刻用sephadex G-50 凝膠過濾，去除游離熒光素，分裝、貯存于4℃中（圖3-13）。



圖3-13　標(biāo)記抗體溶液通過sephadex 產(chǎn)膠柱層析分布

　　（二）四乙基羅達(dá)明標(biāo)記抗體方法

　　取1g RB200及PCL52g放在乳缽中研磨5min（在通風(fēng)櫥中）。然后加入10ml無水丙酮，放置5min，不斷攪拌。過濾，用濾液進(jìn)行標(biāo)記抗體。剩余部分吸附在濾紙上，4℃干燥保存。

　　取抗體（20mg/ml）每毫升加入生理鹽水和0.5mol/l pH9.0的碳酸鹽緩沖液各1ml稀釋。逐滴加入0.1ml RB200溶液，邊加入邊攪拌，在0～4℃中結(jié)合12～18h，再用生理鹽水透析5～7h，經(jīng)葡聚糖凝膠G-50柱層析，除去游離熒光素，分裝，貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

　　（三）四甲基異硫氰酸羅達(dá)明標(biāo)記抗體方法

　?。?）Igg 10ml （6mg/ml）在0.01mol/l pH9.5碳酸鹽緩沖液中透析過夜。

　?。?）將四甲基異硫近氰酸羅達(dá)明（每毫克IgG加入5～20μg）溶于二甲亞砜（1mg/ml）,取此溶液300μl，一滴一滴加入蛋白質(zhì)溶液中，同時(shí)電磁攪拌。

　?。?）在室溫中攪拌2h，避光。

　?。?）把結(jié)合物移入直徑3cm,高30cm大小的Bio –Gel P-6層析柱（用0.01mol/l pH8.0的PBS平衡過），流速為1.5ml/min。

　?。?）收集先流出的紅色結(jié)合物，即為標(biāo)記抗體，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　（四）藻紅蛋白標(biāo)記抗體的方法

　　1．巰基化藻紅蛋白（phycoerthrin PE）的制備，600μl的15.5mg/ml鹽酸巰醇亞胺（iminothiolane hydrochloride）加到1.2ml的3.6mg/ml的PE中，和1.2ml PB、pH6.8 混合，裝入透析袋置入50mmol/l pH6.8 PB中透析，4℃過夜，再換用pH7.5PB透析6h。每個(gè)PE分子中可結(jié)合8個(gè)巰基。

　　2．PE-IgG制備　　異雙功能試劑SPDP[n - Succ - inimdyl 3-（2-pyridyldlthio） propinate ] 30μl （1.1mg/ml）的乙醇溶液，加入700μl的4.2mg/ml IgG PB溶液（50mmol/l pH7.5），在室溫中反應(yīng)2.5h。再加入巰基化Pe 400μl（1.7mg/ml）加到500μl反應(yīng)混合液中，室溫反應(yīng)12h，加入100μl的50mmol/L碘乙酸鈉封閉殘余巰基，用PB透析過夜，4℃。加入0.01%Na3N3分裝，4℃保存半年。

　?。ㄎ澹㏄E-標(biāo)記蛋白A方法

　?。?）取4.08mg PE溶于0.1mol/l pH7.4PB（含0.1mol/l NaCl）1ml中，溶解后，取出0.5ml，再加入10μlSPDP無水甲醇液（2.65mg/ml）,SPDP/蛋白摩爾比為10，22℃反應(yīng)5min，過Sephadex G-50（1×17cm）,用100mmol/l pH7.4 PBS（含0.1mol/l NaCl）平衡和洗脫。

　　（2）0.5ml蛋白（2mg/ml）100mmol/l PB（含有100mmol/l NaCl） pH7.4，加入2.6μl上述SPDP甲醇液，SPDP：蛋白=9.5,22℃,40min ,加入25μmol/L二硫蘇糖醇（DTT）pH7.4緩沖液，22℃，25min，同上過Sephadex G-50，收集蛋白A峰。

　?。?）取0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，22℃反應(yīng)6h，混合物4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　以上兩種PE標(biāo)記制品，可zui后溶于0.01mol/l pH7.4PB（含有0.1mol/l DETA、1mol/L碘乙酰胺、1%BSA 和0.1%NaN3）,0～5℃保存。

　　（六）藍(lán)色熒光素標(biāo)記抗體方法

　　Kbaffan等（1986）首先創(chuàng)立了藍(lán)色熒光素標(biāo)記和染色技術(shù)，可進(jìn)行雙標(biāo)記或多標(biāo)記。

　　（1）取7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methyl coumarin, AMC）260μg溶于二甲亞砜25μl中。

　　（2）將上液加入10ml IgG的 巴比妥緩沖液（0.5mol/L,pH8.5,內(nèi)含50～100mg IgG）中，室溫反應(yīng)2h，過Sephadex G-50除去游離熒光素。

　　AMC呈黃色結(jié)晶固體，zui大吸收波長(zhǎng)354nm,zui大熒光波長(zhǎng)430nm。

　　三、熒光抗體質(zhì)量控制

　　對(duì)制備的熒光抗體必須進(jìn)行質(zhì)量鑒定，主要進(jìn)行特異性和敏感性兩個(gè)方面的鑒定。

　?。ㄒ唬┤旧禺愋院兔舾行缘臏y(cè)定

　　1．特異性染色效價(jià)的測(cè)定　　直接染色以倍比稀釋熒光抗體溶液如1：2，1：4，1：8……，與相應(yīng)抗原標(biāo)本作一系列染色，熒光強(qiáng)度在“+++”的zui大釋釋度，即為該熒光抗體的染色滴度（效價(jià)）或單位。實(shí)際染色應(yīng)用時(shí)，可取低一個(gè)或兩個(gè)稀釋度（即2～4個(gè)單位），如染色效價(jià)為1：64，實(shí)際應(yīng)用時(shí)可取1：32或1：16。間接染色效價(jià)可按抗核抗體熒光染色法步驟，先用不同稀釋度的熒光抗體染色，結(jié)果以抗核抗體熒光強(qiáng)度“++”為標(biāo)準(zhǔn)，染色用效價(jià)和直接法相同。

　　2．非特異性染色測(cè)定　　根據(jù)熒光抗體的用途不同，可用相類似的抗原切片或涂片，倍比稀釋熒光抗體，按常規(guī)染色，結(jié)果在標(biāo)本上出現(xiàn)的非特異染色應(yīng)顯著低于特異染色滴度，否則應(yīng)采取消除非特異性染色的方法處理熒光抗體。

　　3．吸收試驗(yàn)　　在熒光抗體中加入過量相應(yīng)抗原，于室溫中攪拌2h后，移入4℃中過夜，3000r/min,離心30min，收集上清液，再用以染相應(yīng)抗原陽性標(biāo)本，結(jié)果應(yīng)不出現(xiàn)明顯陽性熒光。

　　4．抑制試驗(yàn)如前述。

　?。ǘ〧/P比值的測(cè)定

　　F（熒光素）和P（抗體蛋白）的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量，一般要求F/P的克分子比值為1～2。過高時(shí)，非特異性染色增強(qiáng)；過低時(shí)，熒光很弱，降低敏感性。

　　1．蛋白質(zhì)定量 　　測(cè)定熒光抗體的蛋白質(zhì)mg/ml量。

　　2．結(jié)合熒光素定量 　先制作熒光素定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，即準(zhǔn)確稱取FITC1mg,溶于10ml 0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液中，再用0.01mol/l pH7.2PBS稀釋到100ml，此時(shí)熒光素含量為10 μg/ml，以此為原液，再倍比稀釋9個(gè)不同濃度的溶液，用分光光度計(jì)在490nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值（OD），以光密度為縱坐標(biāo)，熒光素含量為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)圖。

　　熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其吸收光譜峰值向長(zhǎng)波方向位移約5nm,FITC和蛋白質(zhì)結(jié)合后由490nm變?yōu)?93～495nm，RB200和蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)?95nm。

　　F/P比值的計(jì)算：可按以下公式計(jì)算。



　　式中160000為抗體蛋白質(zhì)的分子量，390為FITC的分子量。蛋白質(zhì)從克換算為毫克需再乘以103，而熒光素從克換算為微克需要再乘以106。

　　測(cè)定RB200熒光抗體的克分子比值公式如下：



　　按圖3-4測(cè)定法更為簡(jiǎn)便，即先用276nm波長(zhǎng)測(cè)得蛋白質(zhì)的OD值，再用493波長(zhǎng)測(cè)得FITC的OD值，將這兩個(gè)OD值在圖3-14上連成一直線，直線與各縱線交叉處，即可查出標(biāo)記抗體的以下數(shù)值：FITc μg/ml ，F(xiàn)/P 的μg/mg,F/P的克分子比值，蛋白mg/ml等。



圖3-14　 FITC標(biāo)記物中球蛋白、熒光色素和E/P比值計(jì)算圖

　　四、熒光抗體的保存

　　以0～4℃或-20℃低溫保存，防止抗體活性降低和蛋白變性。加入濃度為1：5000～10000的硫柳汞或1：1000～5000的疊氮鈉防腐，小量分裝如0.1～1ml，真空干燥后更易長(zhǎng)期保存。

[NextPage]　第三節(jié)　免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色方法

　　一、標(biāo)本制作

　　可制作涂片、印片、細(xì)胞單層培養(yǎng)物、組織切片，經(jīng)適當(dāng)固定或不固定，作免疫熒光染色用。

　　二、熒光抗體染色方法

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　　1．染色 切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價(jià)如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等），在室溫或37℃染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內(nèi)，防止干燥。

　　2．洗片 　傾去存留的熒光抗體，將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次，攪拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結(jié)晶。

　　3．用50%緩沖（0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0～9.5）甘油封固、鏡檢

　　4．對(duì)照染色

　　①正常免熒光血清染色，如上法處理切片，結(jié)果應(yīng)為陰性。②染色抑制試驗(yàn)（一步法）：將熒光抗體和未標(biāo)記的抗體球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法處理切片。結(jié)果應(yīng)為陰性。為證明此種染色抑制不是由于熒光抗體被稀釋所致，可用鹽水代替未標(biāo)記抗血清，染色結(jié)果應(yīng)為陽性。此法結(jié)果較二步法穩(wěn)定。③類屬抗原染色試驗(yàn)，前面已作敘述。

　　直接法比較簡(jiǎn)單，適合做細(xì)菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應(yīng)的抗原，特異性高而敏感性較低。

　　（二）間接法

　?。?）切片固定后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體。

　?。?）再滴加間接熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等），同上步驟，染色30min，37℃，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。

　　對(duì)照染色：①抗體對(duì)照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進(jìn)行染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。②抗原對(duì)照：即類屬抗原染色，亦應(yīng)為陰性。③陽性對(duì)照。

　　間接法中上述方法稱雙層法（Double Layer Method）。另一種稱夾心法，即用未標(biāo)記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應(yīng)抗體結(jié)合，再用該抗原之熒光抗體重疊結(jié)合其上，而間接地顯示出組織和細(xì)胞中抗體的存在，方法步驟如下：

　　①切片或涂片固定后，置于染色濕盒內(nèi)。

　?、诘渭游礃?biāo)記的特異性抗原作用切片于37℃，30min。

　?、劬彌_鹽水洗2次，每次5min，吹干。

　?、艿渭犹禺愋詿晒饪贵w再用切片于37℃，30min。

　?、萑纰鬯?。

　?、蘧彌_甘油封固，鏡檢。

　　間接法只需制備一種熒光抗體可以檢出多種抗原，敏感性較高，操作方法較易掌握，而且能解決一些不易制備動(dòng)物免疫血清的病原體（如麻疹）等的研究和檢查，所以已被廣泛應(yīng)用于自身抗體和感染病人血清的試驗(yàn)。

　　（三）補(bǔ)體法

　　1．材料

　?。?）免疫血清60℃滅活20min，用Kolmers 鹽水作2倍稀釋成1：2，1：4，1：8……。補(bǔ)體用1：10稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補(bǔ)體熒光抗體等，按下述的補(bǔ)體法染色。免疫血清補(bǔ)體結(jié)合的效價(jià)，如為1：32則免疫血清應(yīng)作1：8稀釋。

　?。?）補(bǔ)體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試管法所測(cè)定的結(jié)果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中，溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。

　?。?）抗補(bǔ)體熒光抗體：在免疫血清效價(jià)為1：4，補(bǔ)體為2單位的條件下，用補(bǔ)體染色法測(cè)定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價(jià)，然后按染色效價(jià)1：4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。

　　2．方法步驟

　?。?）涂片或切片固定。

　?。?）吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋之免疫血清及補(bǔ)體之等量混合液（此時(shí)免疫血清及補(bǔ)體又都稀釋一倍）滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定濕度的染色盒內(nèi)。

　?。?）用緩沖鹽水洗2次，攪拌，每次5min，吸干標(biāo)本周圍水液。

　?。?）滴加經(jīng)過適當(dāng)稀釋之抗補(bǔ)體熒光抗體30min，37℃，水洗同（3）。

　?。?）蒸餾水洗1min，緩沖甘油封固。

　　3．對(duì)照染色

　　（1）抗原對(duì)照。

　?。?）抗血清對(duì)照：用正常兔血清代替免疫血清。

　?。?）滅活補(bǔ)體對(duì)照：將補(bǔ)體經(jīng)56℃30min處理后，按補(bǔ)體同樣比例稀釋，與免疫血清等量混合后，進(jìn)行補(bǔ)體法染色。

　　本法之熒光抗體不受免疫血清的動(dòng)物種屬的限制，因而一種熒光抗體可作更廣泛的應(yīng)用，敏感性亦較間接法高，效價(jià)低的免疫血清亦可應(yīng)用，節(jié)　省免疫血清，尤其是對(duì)檢查形態(tài)小的如立克氏體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質(zhì)時(shí)甚為理想。

　　（四）膜抗原熒光抗體染色法

　　本法應(yīng)用直接法或間接法的原理和步驟，可對(duì)活細(xì)胞在試管內(nèi)進(jìn)行染色，常用于T和B細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、瘤細(xì)胞抗原和受體等的檢查和研究，陽性熒光主要在細(xì)胞膜上。FACS即采用此法原理。

　?。ㄎ澹╇p重染色法

　　在同一標(biāo)本上有兩個(gè)抗原需要同時(shí)顯示（如A抗原和B抗原），A抗原的抗體用FITC標(biāo)記，B抗原的抗體用羅達(dá)明標(biāo)記，可采用以下染色方法：

　　1．一步法雙染色　 先將兩種標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例混合（A+B），按直接法進(jìn)行染色。

　　2．二步法雙染色 先用RB200標(biāo)記的B抗體染色，不必洗去，再用FITC標(biāo)記的A抗體染色，按間接法進(jìn)行。

　　結(jié)果：A抗原陽性熒光呈現(xiàn)綠色，B抗原陽性呈現(xiàn)桔紅色熒光。

　　（六）熒光抗體再染色法

　　若切片或其他標(biāo)本經(jīng)某種熒光抗體染色后，未獲得陽性結(jié)果，而又疑有另外的病原體存在時(shí)，可用相應(yīng)的熒光抗體再染色。

　　有時(shí)存檔蠟塊不能再用以切片，也可用存檔的HE染色標(biāo)本，褪去蓋片和顏色，再作免疫熒光或其它免疫細(xì)胞化學(xué)的染色。

　　三、熒光抗原染色法

　　某些抗原可以用熒光素標(biāo)記，制成熒光抗原，標(biāo)記熒光素的方法與制備熒光抗體方法相同。用熒光抗原可以直接檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗體，特異性較好，敏感性較差。染色方法同熒光抗體染色的直接法。由于多數(shù)抗原難以提純或量少不昂貴，一般很少采用此法。

第四節(jié)　熒光顯微鏡檢查法

　　一、熒光顯微鏡

　　熒光顯微鏡是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的基本工具。它是由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像（圖3-15）。



圖3-15　熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)和主要部件

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　　現(xiàn)在多采用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充一定數(shù)量的汞，工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀*蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)50～70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。

　　超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太高。

　　新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時(shí)間后，則需要高壓?jiǎn)?dòng)（約為15000V），啟動(dòng)后，維持工作電壓一般為50～60V，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開動(dòng)一次工作時(shí)間愈短，則壽命愈短，如開一次只工作20min，則壽命降低50%。因此，使用時(shí)盡量減少啟動(dòng)次數(shù)。燈泡在使用過程中，其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動(dòng)。點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不*而損壞電極，一般需要等15min。由于超高壓汞燈壓力很高，紫外線強(qiáng)烈，因此燈泡必須置燈室中方可點(diǎn)燃，以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時(shí)造成操作。

　　超高壓汞燈（100W或200W）光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流、啟動(dòng)幾個(gè)部分。在燈室上有調(diào)節(jié)　燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng)，燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡，前面安裝有集光透鏡。

　　國(guó)產(chǎn)超高壓汞燈GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的進(jìn)口燈泡，平均壽命在200h以上，價(jià)格也比較低。

　　我國(guó)研制的一種簡(jiǎn)易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置，體積小，重量輕，功率小，交、直流兩用（自帶直流電源），易于攜帶，使用方便，已推廣應(yīng)用。

　?。ǘV色系統(tǒng)

　　濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號(hào)，各廠家名稱常不統(tǒng)一。濾板一般都以基本色調(diào)命名，前面字母代表色調(diào)，后面字母代表玻璃，數(shù)字代表型號(hào)特點(diǎn)。如德國(guó)產(chǎn)品（Schott）BG12，就是種藍(lán)色玻璃，B是藍(lán)色的*個(gè)字母，G是玻璃的*個(gè)字母；我國(guó)產(chǎn)品的名稱已統(tǒng)一用拼音字母表示，如相當(dāng)于BG12的藍(lán)色濾板名為QB24，Q是青色（藍(lán)色）拼音的*個(gè)字母，B是玻璃拼音的*個(gè)字母。不過有的濾板也可以透光分界濾長(zhǎng)命名，如K530，就是表示壓制濾長(zhǎng)530nm以下的光而透過530nm以上的光。還有的廠家的濾板*以數(shù)字命名，如美國(guó)Corning廠的NO：5-58，即相當(dāng)于BG12。

　　用于熒光顯微鏡的主要濾板如表3-1。

表3-1 熒光顯微鏡常用濾板型號(hào)和透光特點(diǎn)

 

基本色調(diào)	相應(yīng)名稱				2mm厚透光范圍（峰值）nm
	上海電器元件廠	德國(guó)（Schott）	蘇聯(lián)	日本
黑紫	ZWB-1	UG-1	yΦC-2	DV-1	300～400（365）
黑紫	ZWB-2	UG-5	yΦC-1		280～240（360）
靛藍(lán)	ZB-2	BG-1	ΦC-1	BG-1	300～500（380）
靛藍(lán)	ZB-3	BG-3	CC-4	BG-3	260～520（400）
靛藍(lán)	QB-24	BG-12	CC-8	BG-12	310～570（420）
淡藍(lán)	QB-10	BG-38	C3C-5		310～720（460）
	QB-12		-8
			-11
橙黃	CB-3	OG-1（K530）	OC-11	OG-1	530以上
橙黃	JB-8	OG-4（K510）	ЖC-18	FY-5	510以上
綠橙	JB-7	GG-11（K490）	ЖC-17	FY-3	480以上
				FY-4
淡綠	JB-4	GG-3（K430）	жC-11	US-10	420以上

 

　　引自：五九一節(jié)　五*編：熒光顯微術(shù)，見參考資料）

　　1．激發(fā)濾板　 根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn)，可選用以下三類激發(fā)濾板，提供一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。

　　紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號(hào)為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。

　　紫外藍(lán)光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內(nèi)的光通過。常用型號(hào)為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。

　　紫藍(lán)光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過。常用型號(hào)為QB24（BG12）。

　　zui大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達(dá)明色素）可用藍(lán)綠濾板（如B-7）激發(fā)。

　　近年開始采用金屬膜干涉濾板，由于針對(duì)性強(qiáng)，波長(zhǎng)適當(dāng)，因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITCKP490濾板和羅達(dá)明的S546綠色濾板，均遠(yuǎn)比玻璃濾板效果好。

　　激發(fā)濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些?；疽笫且垣@得zui明亮的熒光和的背景為準(zhǔn)。

　　2．壓制濾板 壓制濾板的作用是*阻擋激發(fā)光通過，提供相應(yīng)濾長(zhǎng)范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對(duì)應(yīng)，常用以下3種壓制濾板：

　　紫外光壓制濾板：可通過可見光、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。

　　紫藍(lán)光壓制濾板：能通過510nm以上濾長(zhǎng)的熒光（綠到紅），能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。

　　紫外紫光壓制濾板：能通過460nm以上波長(zhǎng)的熒光（藍(lán)到紅），可與BG-3組合，常用OG-11K470AK 490，K510。

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　　反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因?yàn)殇X對(duì)紫外光和可見光的藍(lán)紫區(qū)吸收少，反射達(dá)90%以上，而銀的反射只有70%；一般使用平面反光鏡。

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　　專為熒光顯微鏡設(shè)計(jì)制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種。還有相差熒光聚光器。

　　1．明視野聚光器　 在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強(qiáng)，使用方便，特別適于低、中倍放大的標(biāo)本觀察。

　　2．暗視野聚光器 　暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛。因?yàn)榧ぐl(fā)光不直接進(jìn)入物鏡，因而除散射光外，激發(fā)光也不進(jìn)入目鏡，可以使用薄的激發(fā)濾板，增強(qiáng)激發(fā)光的強(qiáng)度，壓制濾板也可以很薄，因紫外光激發(fā)時(shí)，可用無色濾板（不透過紫外）而仍然產(chǎn)生黑暗的背景。從而增強(qiáng)了熒光圖像的亮度和反襯度，提高了圖像的質(zhì)量，觀察舒適，可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細(xì)微熒光顆粒。

　　3．相差熒光聚光器　 相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時(shí)進(jìn)行相差和熒光聯(lián)合觀察，既能看到熒光圖像，又能看到相差圖像，有助于熒光的定位準(zhǔn)確。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。

　　（五）物鏡

　　各種物鏡均可應(yīng)用，但用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能（波長(zhǎng)范圍）適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數(shù)成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大 時(shí)其影響非常明顯。因此對(duì)熒光不夠強(qiáng)的標(biāo)本，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡，配合以盡可能低的目鏡（4×,5×，6.3×等）。

　　（六）目鏡

　　在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡，如5×和6.3×。過去多用單筒目鏡，因?yàn)槠淞炼缺入p筒目鏡高一倍以上，但目前研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀察很方便。

　　（七）落射光裝置

　　新型的落射光裝置是從光源來的光射到干涉分光濾鏡后，波長(zhǎng)短的部分（紫外和紫藍(lán)）由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射，當(dāng)濾鏡對(duì)向光源呈45。傾斜時(shí)，則垂直射向物鏡，經(jīng)物鏡射向標(biāo)本，使標(biāo)本受到激發(fā)，這時(shí)物鏡直接起聚光器的作用。同時(shí)，濾長(zhǎng)長(zhǎng)的部分（綠、黃、紅等），對(duì)濾鏡是可透的，因此，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發(fā)濾板作用，由于標(biāo)本的熒光處在可見光長(zhǎng)波區(qū)，可透過濾鏡而到達(dá)目鏡觀察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)增大而提高，在高放大時(shí)比透射光源強(qiáng)。它除具有透射式光源的功能外，更適用于不透明及半透明標(biāo)本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養(yǎng)標(biāo)本等的直接觀察。近年研制的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置，稱之為落射熒光顯微鏡。

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　　二、熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求

　?。ㄒ唬┹d玻片

　　載玻片厚度應(yīng)在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。

　?。ǘ┥w玻片

　　蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對(duì)不同波長(zhǎng)的光起不同干涉作用的物質(zhì)（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā)光女可激發(fā)標(biāo)本。

　?。ㄈ?biāo)本

　　組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外，細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。

　?。ㄋ模┓怦褎?/p>

　　封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時(shí)較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。

　?。ㄎ澹╃R油

　　一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須使用鏡油，使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對(duì)圖像質(zhì)量略有影響。

　　三、使用熒光顯微鏡的注意事項(xiàng)

　?。?）嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。

　?。?）應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛*適應(yīng)暗室，再開始觀察標(biāo)本。

　　（3）防止紫外線對(duì)眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。

　?。?）檢查時(shí)間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱；所以，zui多不得超過2～3h。

　?。?）熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)　省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí)，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。

　?。?）標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)。

　?。?）熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般分為四級(jí)，即“一”—無或可見微弱熒光。“+”—僅能見明確可見的熒光。“++”—可見有明亮的熒光。“+++”—可見耀眼的熒光。

　　四、熒光圖像的記錄方法

　　熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時(shí)，必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo)，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術(shù)科學(xué)的發(fā)展，在不同程度上采用客觀指標(biāo)記錄判斷結(jié)果，如用細(xì)胞分光光度計(jì)，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果，也必須結(jié)合主觀的判斷。

　　熒光顯微鏡攝影技術(shù)對(duì)于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時(shí)攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對(duì)熒光猝滅作用大，如FITC的標(biāo)記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動(dòng)或全自動(dòng)顯微攝影系統(tǒng)裝置。

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第五節(jié)　非特異性染色的消除方法

　　一、非特異性染色的主要因素

　　組織的非特異性染色的機(jī)理很復(fù)雜，其產(chǎn)生的原因主要可分為以下幾點(diǎn)：

　　（1）一部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。

　?。?）抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結(jié)合。

　?。?）除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應(yīng)抗體結(jié)合。

　　（4）從組織中難于提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。

　?。?）抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多，這種過量標(biāo)記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。

　　（6）熒光素不純，標(biāo)本固定不當(dāng)?shù)取?/p>

　　二、消除非特異性染色的方法

　　消除熒光抗體非特異性染色的方法應(yīng)根據(jù)產(chǎn)生的原因采取適當(dāng)?shù)姆椒?，常用的方法有以下幾種：

　?。ㄒ唬﹦?dòng)物臟器粉末吸收法

　　常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50～100mg,在離心管中充分混勻，在室溫中振動(dòng)2h，4℃中過夜，再攪拌10min，高速離心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般應(yīng)在臨用前進(jìn)行，吸收后之熒光抗體保存冰箱中勿超過2周。染色應(yīng)作吸收前后之比較，吸收時(shí)可先用緩沖鹽水將組織干粉浸濕，離心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入熒光抗體進(jìn)行吸收，以免消耗過多的抗體。

　　肝粉或新鮮細(xì)胞吸收是一種非特異性的消除方法，對(duì)熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸附作用。如檢查組織中的病毒抗原時(shí)，也可用相同的組織干粉或勻漿沉淀物吸收之。

　　用臟器肝粉吸收對(duì)熒光抗體損失較多，如果根據(jù)Hiramotos氏等的方法將組織的20%生理鹽水勻漿液，用生理鹽水洗2～3次，12000r/min 10min離心沉淀，用其沉淀物吸收其熒光抗體即能*達(dá)到目的，京極方久氏認(rèn)為這樣吸收對(duì)熒光抗體幾乎沒有損失，他們常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用時(shí)有必要再吸收一次。

　　【肝粉的制法】

　　（1）將若干只小白鼠或大白鼠放血?dú)⑺?，取出肝臟，用生理鹽水洗2～3次，除去血液，剝掉表面的結(jié)締組織的脂肪。

　?。?）剪碎，用生理鹽水反復(fù)洗滌至無血色止，然后再加生理鹽水少許，用組織搗碎機(jī)或勻漿器作成勻漿。

　　（3）將肝勻漿裝入離心管內(nèi)（1/3左右），交換地用2～3倍量生理鹽水和丙酮反復(fù)洗滌各三次，至上清無血色止，每次完畢先用2000r/min離心沉淀15min后，再除去上清液。

　?。?）zui后用丙酮洗滌肝漿，再用布氏漏斗過濾，或離心沉淀，將沉淀物平鋪在潔凈的玻璃板上，37℃烤干（過夜）。

　?。?）在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩選過后，分裝，密封，低溫干燥保存。

　?。ǘ┩肝龇?/p>

　　熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質(zhì)大分子不能透過，可將未與蛋白結(jié)合的熒光素透析除去。

　?。?）將標(biāo)記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內(nèi)，液面稍留空隙，緊扎。

　?。?）浸入0.02mol/ph 7.1～7.4的PBS中（懸于大于標(biāo)記物體積約50～100倍的PBS內(nèi)），在4℃中透析，每日更換3～4次PBS，約5～7天，透析液中無熒即可（在熒光光源照射下）。

　?。ㄈ┢暇厶悄zG-50柱層析法

　　除游離熒光素可用2×46cm柱層析法，詳細(xì)方法參閱第二章　。加入熒光抗體15～18ml（按床體積的5%～10%加樣），使其緩慢滲入柱內(nèi)，待即將全部入柱時(shí)，加入PBS少許，關(guān)閉下口，停留30～40min ，使游離熒光充分進(jìn)入細(xì)篩孔中，然后再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量后，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留于上端的游離熒光素之間拉開明顯的界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來越大，熒光抗體zui先流出，分前、中、后三部分收集，測(cè)F/P比值，合格者合并，濃縮，分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測(cè)定蛋白（發(fā)生沉淀反應(yīng)），繼續(xù)洗脫，游離熒光素則相繼被洗脫下來，至洗脫液中無蛋白和熒光素后，此層析柱即可再用。

　　若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類，可先在過柱前透析一夜，否則，NH4+太濃，在蛋白未*洗脫時(shí)即出現(xiàn)NH4+，因而影響提純與回收蛋白，一般待洗脫液出現(xiàn)蛋白時(shí)，即進(jìn)行收集，之后出現(xiàn)SO4++（用1%BaCl2檢查發(fā)生白色沉淀）。zui后是NH4+，（用納氏試劑檢查呈黃棕色沉淀），待洗脫液無SO4++及NH4+后可再用。

　　如僅用小量熒光抗體，可用1×20cm的柱層析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過濾2～3.5ml熒光抗體。

　　（四）DEAE纖維素柱層析法

　　標(biāo)記過多或過少熒光素的抗體分子可用DEAE-纖維素柱層析法除去。方法如下：

　　DEAE-纖維素柱的裝柱，洗脫、再生方法等與提純IgG方法相同。裝柱所需DEAE-纖維素量以干重每克交換20～50mg標(biāo)記蛋白量為宜。常用梯度洗脫法如下：

　?。?）層析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，標(biāo)記物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脫，洗出無色或淡綠色液體，洗脫液量（根據(jù)床體積大小每梯度乘3），然后依下列各種離子強(qiáng)度洗脫液，分別洗脫和收集：

　　0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/l NaCl）……洗脫部分1。

　　0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/l NaCl）……洗脫部分2。

　　0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/l NaCl）……洗脫部分3。

　　將此三部分收集液（每管5ml）分別測(cè)定其F/P比值，0.05mol/l NaCl pH7.2PB洗脫液280nm光密度高峰管合并，濃縮保存?zhèn)溆?。因這部分非特異性染色熒光zui少，是比較好的熒光抗體。其他兩部分可以廢棄。

　　（2）柱上吸附的過度標(biāo)記蛋白可繼續(xù)增加NaCl的濃度至2.0mol/L洗脫完。

　　經(jīng)過DEAE-纖維素層析后的標(biāo)記抗體，其抗體量一般約損失50%，因此有些要求不太高的抗體，如抗細(xì)菌熒光抗體，不一定要這樣處理，可用染色效價(jià)測(cè)定的稀釋法除去非特異性染色。

　?。ㄎ澹晒饪贵w稀釋法

　　先測(cè)定熒光抗體特異性染色與非特異性染色的效價(jià)，若二者效價(jià)相差較大，則可將熒光抗體稀釋至一臨界濃度，使特異性染色呈陽性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法和染色效價(jià)測(cè)定方法相同。

　?。┘兓乖?/p>

　　用各種方法提純單一成分的抗原是產(chǎn)生單價(jià)特異性抗體的zui主要條件。近代免疫化學(xué)技術(shù)（免疫吸收法）和柱層析法等提供了很大的可能性，可參考有關(guān)專著。

　?。ㄆ撸┘兓贵w法---免疫吸收法

　　例如抗IgA血清的純化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（SIgA）抗原純度不高，所制的抗血清常與IgG呈交叉反應(yīng)，為此需要吸收，常采用純化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收純化。方法如下：

　　1．人IgG聚合物的制備　　在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/l pH7.0磷酸緩沖溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，邊加邊攪，5min即出現(xiàn)混濁，逐現(xiàn)大塊膠塊，放置30min后，用研缽將凝膠磨細(xì)，繼用1.0mol/l pH7.0磷酸緩沖溶液反復(fù)洗滌3次，末次加蒸餾水至20ml，即為人IgG聚合物懸液。

　　2．免疫吸收法　　將待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物懸液，置室溫?cái)嚢?0min,離心沉淀，上清液即稀釋1倍的純化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。

　　（八）伊文氏藍(lán)（Evans blue）襯染法

　　用0.01%伊文氏藍(lán)的0.01mol/l pH7.2PBS稀釋熒光抗體，可將背景細(xì)胞和組織染色，呈紅色熒光，與特異性黃綠色熒光形成鮮明的對(duì)比，減少了非特異性熒光，宜作常規(guī)應(yīng)用。伊文氏藍(lán)一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀釋至0.01%用以和然釋熒光抗體。

　　此外，還可以用胰酶消化組織切片或用10%牛血清蛋白封閉法等消除非特異性染色，提高特異性染